1. G418 atrankos 293T ląstelės veikimo principas
G418 yra neomicino antibiotikas, kuris trukdo tarpląstelinių baltymų sintezei ir taip sukelia ląstelių mirtį. Tačiau ląstelės, turinčios atsparumo neomicinui geną, gali gaminti atsparius baltymus, kad atsispirtų G418 toksiškumui. Todėl auginimo terpėje, kurioje yra G418, išgyventi ir augti gali tik ląstelės, turinčios atsparumo neomicinui geną.
2. G418 koncentracijos įtaka 293T ląstelėms
G418 koncentracijos poveikis 293T ląstelėms yra daugialypis, įskaitant ląstelių augimą, gyvybingumą, ląstelių morfologiją ir ląstelių atsparumą. Specifinis G418 koncentracijos poveikis 293T ląstelėms daugiausia pasireiškia šiais aspektais:
1. Ląstelių augimas: esant žemesnei G418 koncentracijai (pvz., 0.25 mg/ml), 293T ląstelės gali normaliai augti, ląstelių tankis palaipsniui didėja, o morfologija išlieka gera. Didėjant G418 koncentracijai (pvz., 0,5 mg/ml), ląstelių augimo greitis pradeda lėtėti, o ląstelių tankis didėja lėtai. Kai G418 koncentracija pasiekia 1 mg/ml, kai kurios ląstelės pradeda mirti, o ląstelių tankis žymiai sumažėja. Toliau didėjant G418 koncentracijai (pvz., 2 mg/ml), ląstelių mirtis yra rimtesnė ir ląstelių tankis mažėja. 2. Ląstelių gyvybingumas: kuo didesnė G418 koncentracija, tuo mažesnis ląstelių gyvybingumas. Esant mažoms G418 koncentracijoms (pvz., 0.25 mg/ml), ląstelių gyvybingumas yra didelis, ląstelių morfologija pilna, o dažymas vienodas. Didėjant G418 koncentracijai, ląstelių gyvybingumas palaipsniui mažėja, ląstelių morfologija tampa netaisyklinga, o dažymasis netolygus. Esant didelėms G418 koncentracijoms (pvz., 2 mg/ml), ląstelių gyvybingumas yra mažas, ląstelių morfologija yra labai pažeista, o dažymas yra nenormalus.
3. Ląstelių morfologija: kuo didesnė G418 koncentracija, tuo netaisyklingesnė ląstelių morfologija. Esant mažoms G418 koncentracijoms, ląstelių morfologija yra putli, verpstės formos arba plokščia. Didėjant G418 koncentracijai, ląstelių morfologija tampa netaisyklinga, ląstelių tūris mažėja, o ląstelės kraštai neaiškūs. Esant didelėms G418 koncentracijoms, labai pažeidžiama ląstelės morfologija, itin mažas ląstelės korpusas, lūžta ląstelės kraštai.
4. Ląstelių atsparumas: kuo didesnė G418 koncentracija, tuo didesnis ląstelių atsparumas. Esant mažoms G418 koncentracijoms, ląstelės yra jautresnės G418 ir yra linkusios į ląstelių mirtį. Didėjant G418 koncentracijai, ląstelės palaipsniui sukuria atsparumą ir didėja ląstelių išgyvenamumas. Esant didelėms G418 koncentracijoms, ląstelių atsparumas pasiekia piką, o ląstelės gali atsispirti didelės G418 koncentracijos toksiškumui.
Todėl 293T ląstelių G418 atrankos koncentracija paprastai yra tarp 1-2 mg/ml. Ši koncentracija gali būti koreguojama pagal eksperimentinius reikalavimus. Paprastai tariant, kuo didesnė atrankos koncentracija, tuo geresnis atrankos efektas, tačiau tai taip pat sukels tam tikrą žalą ląstelėms. Todėl renkantis atrankos koncentraciją būtina pasverti eksperimento tikslą ir ląstelių toleranciją. Realiai veikiant galite pradėti nuo mažesnės koncentracijos, pvz., 0,5 mg/ml, stebėti ląstelių augimą ir palaipsniui didinti koncentraciją, kol rasite tinkamą atrankos koncentraciją.