Remiantis baltymais ir jų struktūra bei funkcija, gyvybės reiškinių supratimas molekuliniu lygmeniu tapo pagrindine šiuolaikinės biologijos raidos kryptimi. Norėdami ištirti baltymus, pirmiausia turime gauti labai išgrynintas ir biologiškai aktyvias tikslines medžiagas. Baltymų paruošimas apima įvairius fizikos, chemijos ir biologijos aspektus, tačiau pagrindiniai principai yra tik du aspektai. Vienas iš jų yra naudoti kelių komponentų pasiskirstymo mišinyje greičių skirtumus, kad jie būtų paskirstyti į dvi ar kelias fazes, kurias galima atskirti mechaniniais metodais, tokiais kaip išsūdymas, ekstrahavimas organiniais tirpikliais, chromatografija ir kristalizacija ir kt.; antrasis – Mišinys dedamas į vieną fazę, o komponentai paskirstomi į tą pačią sritį veikiant fiziniams jėgos laukams, kad būtų pasiekti atskyrimo tikslai, pvz., elektroforezė, ultracentrifugavimas, ultrafiltravimas ir tt Taikant visas šias priemones. metodais, reikia stengtis išsaugoti biologinių makromolekulių vientisumą ir užkirsti kelią siūlomų medžiagų biologinio aktyvumo praradimui dėl rūgščių, šarmų, aukštos temperatūros ir stipraus mechaninio poveikio. Baltymų paruošimas paprastai skirstomas į šiuos keturis etapus: medžiagos parinkimas ir išankstinis apdorojimas, ląstelių ardymas ir organelių atskyrimas, ekstrahavimas ir gryninimas, koncentravimas, džiovinimas ir konservavimas. Mikroorganizmai, augalai ir gyvūnai gali būti naudojami kaip žaliavos baltymams ruošti, o pasirinktos medžiagos daugiausia parenkamos atsižvelgiant į eksperimento tikslą. Kalbant apie mikroorganizmus, reikia atkreipti dėmesį į jų augimo fazę. Mikroorganizmų logaritminėje augimo fazėje fermentų ir nukleorūgščių kiekis yra didelis, galima gauti didelį derlių. Yra dvi situacijos naudojant mikroorganizmus kaip medžiagas: (1) Mikrobų ląstelių sekrecija turi būti naudojama. Metabolitai ir tarpląsteliniai fermentai auginimo terpėje; (2) Naudokite bakterijose esančias biochemines medžiagas, tokias kaip baltymai, nukleino rūgštys ir tarpląsteliniai fermentai. Augalinės medžiagos turi būti išlukštentos ir nuriebalintos, taip pat reikia atkreipti dėmesį į skirtingas augalų veisles ir augimo bei vystymosi sąlygas. Juose esančių biologinių makromolekulių kiekis labai skiriasi ir yra glaudžiai susijęs su sezoniškumu. Gyvūnų audiniams kaip žaliava turi būti atrenkami organų audiniai, kuriuose gausu veikliųjų medžiagų, kurie pirmiausia turi būti sumalti ir nuriebalinti. Be to, iš anksto apdorotas medžiagas reikia užšaldyti ir sandėliuoti, jei jos iš karto nepanaudojamos eksperimentams, o iš šviežių medžiagų reikia paruošti lengvai skaidomas biomakromolekules. Baltymų atskyrimas ir gryninimas 1. Baltymų (įskaitant fermentus) ekstrahavimas Dauguma baltymų tirpsta vandenyje, praskiestoje druskoje, praskiestuose rūgščių ar šarmų tirpaluose, o nedidelis kiekis baltymų, susijungusių su lipidais, tirpsta organiniuose tirpikliuose, tokiuose kaip etanolis, acetonas, butanolis ir pan. Todėl baltymams ir fermentams ekstrahuoti, atskirti ir gryninti gali būti naudojami skirtingi tirpikliai. (1) Ekstrahavimo vandeniniu tirpalu metodas. Praskiestos druskos ir buferinės sistemos vandeninis tirpalas turi gerą stabilumą ir didelį baltymų tirpumą. Tai dažniausiai naudojamas tirpiklis baltymams ekstrahuoti. Įprasta dozė yra 1-5 kartų didesnė už žaliavos tūrį. Ekstrahavimo metu reikia tolygiai maišyti, kad būtų lengviau ištirpinti baltymus. Ekstrahavimo temperatūra priklauso nuo veikliųjų medžiagų savybių. Viena vertus, daugumos baltymų tirpumas didėja didėjant temperatūrai. Todėl aukšta temperatūra yra palanki tirpimui ir sutrumpina ekstrahavimo laiką. Tačiau, kita vertus, kylanti temperatūra denatūruos ir inaktyvuos baltymus. Todėl, remiantis šiuo samprotavimu, išgaunant baltymus ir fermentus paprastai naudojamos žemos temperatūros (žemiau 5 laipsnių) operacijos. Siekiant išvengti skilimo baltymų ekstrahavimo metu, galima pridėti proteolitinių fermentų inhibitorių (tokių kaip diizopropilo fluorofosfatas, jodoacto rūgštis ir kt.).
Koncentravimas, džiovinimas ir konservavimas 1. Mėginių koncentravimas Biologinių makromolekulių paruošimo procese mėginiai labai atskiesta dėl gryninimo kolonėlėmis. Siekiant išsaugoti ir identifikuoti, dažnai reikia susikaupti. Dažniausiai naudojami koncentravimo metodai: 1. Dekompresijos ir kaitinimo garavimo koncentracija sumažina skysčio virimo temperatūrą, sumažindama skysčio paviršiaus slėgį. Kuo didesnis vakuuminis dekompresijos laipsnis, tuo žemesnė skysčio virimo temperatūra ir tuo greičiau jis išgaruoja. Šis metodas tinka kai kuriems pacientams, kurie netoleruoja karštų biologinių makromolekulių koncentracijos. 2. Oro srautas išgaruoja ir koncentruojasi. Oro srautas gali pagreitinti skysčio išgaravimą ir paskleisti tirpalą plonu sluoksniu, oro srautui nuolat einant per paviršių; arba įdėkite biologinės makromolekulės tirpalą į dializės maišelį ir padėkite į šaltą patalpą, o ventiliatoriumi išpūskite orą. Tirpiklis, praeinantis per membraną, neišgaruoja, kad pasiektų koncentracijos tikslą. Šis metodas pasižymi lėtu koncentravimo greičiu ir netinka koncentruoti didelius tirpalo kiekius. 3. Užšaldymo būdas: biologinės makromolekulės žemoje temperatūroje užšąla į ledą. Druskos ir biologinės makromolekulės į ledą nepatenka, o lieka skystoje fazėje. Eksploatacijos metu koncentruojamas tirpalas pirmiausia atšaldomas, kad virstų kieta medžiaga, o po to lėtai ištirpsta. Skirtumas tarp tirpiklio ir tirpios medžiagos lydymosi temperatūrų naudojamas siekiant pašalinti didžiąją tirpiklio dalį. Pavyzdžiui, šiuo metodu koncentruojant baltymų ir fermentų druskos tirpalą, skysčio paviršiuje plūduriuoja gryni ledo kristalai be baltymo ir fermento, o baltymas ir fermentas koncentruojasi apatiniame tirpale. Pašalinus viršutinius ledo kubelius, galima gauti baltymų ir fermentų koncentraciją. skystis. 4. Absorbcijos metodas: tirpalo molekulės tirpale yra tiesiogiai surenkamos per absorbentą, kad jis būtų sukoncentruotas. Naudojamas absorbentas neturi chemiškai reaguoti su tirpalu, neturi adsorbuoti biologinių makromolekulių ir būti lengvai atskiriamas nuo tirpalo. Dažniausiai naudojami absorbentai yra polietilenglikolis, polivinilpirolidonas, sacharozė ir gelis. Kai naudojate polietilenglikolio sugėriklius, pirmiausia įpilkite biologinės makromolekulės tirpalo į pusiau pralaidų membraninį maišelį ir įpilkite polietilenglikolio. Uždengtas alkoholiu ir esantis 4 laipsnių Celsijaus temperatūroje, iš maišelio išsiveržęs tirpiklis greitai sugers polietilenglikolio. Po to, kai polietilenglikolis prisotinamas vandeniu, jį reikia pakeisti nauju, kol bus pasiektas reikiamas tūris. 5. Ultrafiltravimas Ultrafiltravimas – tai metodas, kai naudojant specialią membraną selektyviai filtruojamos įvairios tirpalo molekulės. Kai skystis praeina per membraną esant tam tikram slėgiui (azoto slėgiui arba vakuuminio siurblio slėgiui), tirpiklis ir mažos molekulės yra blokuojamos ir išlaikomos. Tai naujas metodas, sukurtas pastaraisiais metais. Labiausiai tinka biologinių makromolekulių, ypač baltymų ir fermentų, koncentravimui arba gėlinimui. Jis turi mažą kainą, lengvą valdymą, švelnias sąlygas ir gali būti geriau prižiūrimas. Jis pasižymi dideliu biologinių makromolekulių aktyvumu ir dideliu atkūrimo greičiu. Svarbiausia taikant ultrafiltraciją yra membranų pasirinkimas. Skirtingi membranų tipai ir specifikacijos turi skirtingus parametrus, tokius kaip vandens srauto greitis ir molekulinės masės ribinė vertė (ty mažiausia molekulių masės vertė, kurią gali išlaikyti membrana), ir turi būti parenkamos atsižvelgiant į darbo poreikius. Be to, ultrafiltravimo įtaiso forma, tirpių medžiagų sudėtis ir savybės, tirpalo koncentracija ir kt. turi tam tikrą įtaką ultrafiltravimo efektui. Tuščiaviduriai pluošto vamzdeliai yra pagaminti iš ultrafiltravimo membranų, o daugelis tokių vamzdelių surenkami į ryšulį. Abu vamzdžių galai yra prijungti prie mažo joninio stiprumo buferio, kad buferis nuolat tekėtų vamzdyje. Tada pluošto vamzdelis panardinamas į dializuojamą baltymų tirpalą. Kai buferis teka per pluošto vamzdelį, mažos molekulės gali lengvai difuzuoti per membraną, bet didelės molekulės negali. Tai pluošto filtravimo dializės metodas. Dėl padidėjusio dializės ploto dializės laikas sutrumpėja 10 karto. 2. Džiovinimas: Siekiant išvengti gedimo ir palengvinti laikymą, iš biologinių makromolekulių paruoštus produktus dažnai reikia džiovinti. Dažniausiai naudojami metodai yra džiovinimas šalčiu ir džiovinimas vakuume. Vakuuminis džiovinimas tinka džiovinti ir konservuoti medžiagas, kurios nėra atsparios aukštai temperatūrai ir yra linkusios oksiduotis. Be džiovintuvo, kondensatoriaus ir vakuuminio džiovinimo principo, visas įrenginys taip pat prideda temperatūros koeficientą. Esant tokiam pat slėgiui, vandens garų slėgis mažėjant temperatūrai mažėja, todėl esant žemai temperatūrai ir žemam slėgiui ledas lengvai sublimuoja į dujas. Eksploatacijos metu džiovinamas skystis paprastai pirmiausia užšaldomas žemiau užšalimo temperatūros, kad jis virstų kietu pavidalu, o tada tirpiklis žemoje temperatūroje ir žemame slėgyje paverčiamas dujomis ir pašalinamas. Šiuo metodu džiovinti produktai pasižymi purumu, geru tirpumu, natūralios struktūros išlaikymu, tinka įvairioms biologinėms makromolekulėms džiovinti ir konservuoti. 3. Sandėliavimas Biologinių makromolekulių stabilumas yra glaudžiai susijęs su laikymo būdu. Sausi produktai paprastai yra gana stabilūs, o jų aktyvumas gali išlikti nepakitęs kelias dienas ar net metus esant žemai temperatūrai. Laikymo reikalavimai yra paprasti, jei džiovinti mėginiai dedami į eksikatorių (sudėtyje yra desikanto) ir sandariai uždaromi bei laikomi 0-4 Laikant skysčius reikia atkreipti dėmesį į šiuos dalykus: 1. Mėginys neturi būti per daug praskiesti. Prieš pakuojant ir sandėliuojant, jis turi būti sukoncentruotas iki tam tikros koncentracijos. Per daug praskiestas mėginys gali lengvai denatūruoti biologines makromolekules. 2. Paprastai reikia dėti konservantų ir stabilizatorių. Dažniausiai naudojami konservantai yra toluenas, benzenkarboksirūgštis, chloroformas, timolis ir kt. Dažniausiai naudojami baltymų ir fermentų stabilizatoriai yra amonio sulfato pasta, sacharozė, glicerolis ir kt. Fermentams taip pat galima pridėti substratų ir kofermentų, kad pagerintų jų stabilumą. Be to, tirpalai, tokie kaip kalcis, cinkas ir boro rūgštis, taip pat turi tam tikrą apsauginį poveikį tam tikriems fermentams. Nukleino rūgšties makromolekulės paprastai laikomos standartiniuose natrio chlorido arba natrio citrato buferiniuose tirpaluose. 3. Laikymo temperatūros reikalavimai yra žemi, dauguma yra laikomi šaldytuvuose apie 0 laipsnių, o kai kuriems reikalinga žemesnė temperatūra, priklausomai nuo skirtingų medžiagų.